為什么開展熒光Western Blotting？

概述

     熒光western blotting（WB）檢測系統越來越受歡迎，因為與化學發光或顯色檢測系統相比，它在化學發光檢測方面節省了更多的時間，減少了化學廢物。過去，熒光Western Blot由于檢測靈敏度或檢測儀器過于昂貴而令人望而卻步。隨著新型熒光探針的開發，成像技術的進步，以及兩者成本的降低，熒光WB正在迅速取代許多實驗室的顯色和化學發光檢測方法。雖然熒光檢測限還沒有化學發光檢測那么低，但熒光檢測具有獨特的優點，可以在同一印跡上同時檢測多個目標，而不需要剝離和重新孵育。

圖1 化學發光western blot檢測原理示意圖

圖2 熒光western blot檢測原理示意圖

       在熒光western blot檢測系統中，信號以光的形式捕獲。熒光基團發出的瞬態光是由被激發的分子返回其正常狀態時光子的激發和隨后的釋放而產生的。相比之下，顯色和化學發光的western檢測系統產生的信號是酶-底物反應的產物。顯色酶-底物反應產生沉淀到膜上的有色產物，而化學發光檢測系統產生以光的形式釋放能量的酶反應。熒光應用可以比酶系統更定量。與酶反應類似，熒光試劑必須根據信噪比進行優化。如果熒光標記的程度過低，信號就會變弱。然而，如果熒光標記的程度過高，信號也會因為檢測試劑的失活或信號的猝滅而變得微弱，這一現象被稱為熒光共振能量傳遞(Forster resonance energy transfer, FRET)。與熒光顯微鏡一樣，必須小心選擇經過熒光驗證的支撐或基質材料。典型的印跡膜，如硝基纖維素和聚偏二氟乙烯(PVDF)，已知具有熒光性質，可導致顯著的背景時，使用熒光western印跡。然而，用于熒光檢測的試劑的激發波長和發射波長都是為了避免普通膜的自發熒光而選擇的。特殊的低熒光膜也可用于熒光western blots。

熒光WB檢測的優點

    熒光法使多重western blot分析成為可能，在同一blot上可以同時檢測和分化多個蛋白質。例如，可以通過與熒光染料結合的二抗來檢測兩到三種不同的蛋白質，這種熒光染料的熒光波長不同。二抗偶聯物與熒光染料Alexa Fluor被設計用于多種多樣的熒光蛋白和細胞分析免疫分析方法，包括多種western檢測。與基于酶的化學發光底物檢測相比，熒光western blot檢測除了能實現多路復用外，還有其他幾個優點:

?  能夠在同一時間測定同一斑點上的多個目標

?  在查看多個目標時，不需要剝離和重新探測污點

?  無需擔心底物的孵育時間或膠片曝光

?  節省時間，保存樣品

?  提供可靠的定量數據

量子點熒光WB

    量子點（quantum dot，簡稱QDs）作為一種新型熒光納米晶，具有一些獨特的熒光性能，如熒光發射波長可控、發射峰狹窄對稱、激發波長范圍廣、量子效率高、光穩定性好等，量子點的上述熒光特性為制備高靈敏度的免疫熒光探針提供了很好的選擇。

    量子點Western Blot技術具有靈敏、可定量、多元檢測等特點，早在2005年Ornberg等報道了量子點熒光技術在Western Blot分析中的應用；同年，Bakalova等報道了利用生物素-親和素信號放大的超靈敏Western Blot技術，與傳統的量子點標記物比較，生物素-親和素放大后的量子點Western Blot檢測靈敏度提高5倍，但上述生物素-親和素方法需要額外的孵育步驟，實驗步驟也更復雜。胥傳來等利用生物素-親和素的特異性結合反應，將量子點團聚制備得到親和素化的多聚量子點，然后與膜上的生物素化一抗結合，其對蛋白的檢測線性范圍為30-1500 pg；然而生物素-親和素制備的多聚量子點步驟較復雜且保質期較短，且需要生物素化的一抗，因而在Western Blot的應用中受限制較多。

    盡管目前關于量子點在Western Blot檢測中的應用有較多的報道，但量子點免疫熒光探針在對非常微量的蛋白進行檢測時，還存在信號低，噪音干擾大等問題。因此對目前的量子點免疫熒光探針制備方法進行改進，提高檢測的靈敏度、穩定性和易操作性是目前分析檢測領域迫切的需求。且目前關于量子點在Western Blot檢測中的應用也較少與實驗室常用的化學發光顯色方法進行平行比較。

與現有的技術相比較，本發明具有以下優點：

?  檢測靈敏度更高、信號檢測時無需額外的信號放大步驟、量子點納米球熒光二抗保質期更持久等特點。

?  無需發光底物、檢測信號更穩定可長期保存、結果的一致性和可重復性等特點。

?  熒光信號更穩定、無需避光操作、無需特殊的近紅外激光掃描儀檢測等特點。

                          圖3 化學發光（ECL）與量子點熒光（QBC）檢測Hela細胞中內參蛋白GAPDH的結果比較。

（從左至右各泳道總蛋白上樣量，5,10,15,20,25,30μg）

                             圖4 化學發光（ECL）與量子點熒光（QBC）檢測Hela細胞中內參蛋白Tubulin的結果比較。

（從左至右各泳道總蛋白上樣量，5,10,15,20,25,30μg）

熒光western blotting檢測儀器

       熒光western blotting的結果需要特殊的儀器檢測，即一種熒光成像儀器。一些制造商提供熒光成像儀器，其中大多數使用激光或基于led的照明與濾波器的組合，以提供適當的激發光波長，然后捕獲適當的發射光輸出。多數儀器使用專門的CCD相機來捕捉信號，得到的數據是數字化的結果。

       具有不同激發和發射光譜特性的熒光染料的種類不斷增加。具有非重疊光譜的熒光團可以進行多重分析，從而在同一泳道和同一印跡膜上檢測到兩個或三個不同的目標蛋白，并進行獨立識別。然而，成像儀器必須配備一套適當的激發和發射濾波器，以解決產生的熒光信號。一些儀器專門用于檢測紅外和近紅外熒光體，而另一些儀器則用于分析可見范圍內的多種熒光染料。越來越多的現代儀器可以結合熒光成像在可見光和近紅外/紅外范圍。

       量子點具有較寬的激發光譜，不同發光波長的可以用一個光源同時激發產生不同顏色熒光，這是傳統有機熒光材料所不具有的特點；具有較高的熒光發光效率，量子點檢測不必限定在近紅外區域就可以達到較高的檢測靈敏度，一般紫外光可以激發量子點產生較強的熒光。量子點優異的光學性能，是的量子點熒光WB的檢測儀器大大簡化。一般生物實驗室常用的“紫外凝膠成像儀”就可以滿足檢測要求，大大降低了熒光WB技術的實際應用場景。

  圖5 不同熒光成像儀量子點WB檢測結果的比較